本文轉(zhuǎn)自測(cè)序中國(guó) 作者：戴勝 

近年來(lái)，Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies、Bionano Genomics和10x Genomics等公司的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序和基因組圖譜技術(shù)越來(lái)越受歡迎。隨著相關(guān)技術(shù)的推廣應(yīng)用，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在快速、高效提取高質(zhì)量高分子量DNA方面的痛點(diǎn)日益凸顯。

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)痛點(diǎn)：DNA提取速度、產(chǎn)量是關(guān)鍵

在過(guò)去的基因組研究中，人們可能會(huì)更多的選擇短讀長(zhǎng)測(cè)序?，F(xiàn)在，那些新開(kāi)展的基因測(cè)序研究更愿意選擇PacBio、Oxford Nanopore、Biona0x Genomics等公司的技術(shù)。例如將為地球上所有66,000種脊椎動(dòng)物物種生成參考基因組的脊椎動(dòng)物基因組計(jì)劃(VGP)，就已承諾在研究中使用高通量基因組圖譜技術(shù)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)。

利用目前已有的許多DNA提取標(biāo)準(zhǔn)方法，如色譜柱法和磁珠法，獲得高分子量DNA并不容易。大多數(shù)用戶(hù)終選擇的還是非常傳統(tǒng)的方法，如瓊脂糖包埋純化，通過(guò)將DNA嵌入瓊脂糖凝膠中以保護(hù)其免受溶液體系剪切力的影響；或者進(jìn)行苯酚氯方萃取沉淀。這些方法可以提供純化的長(zhǎng)DNA片段，但缺點(diǎn)是速度慢，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。

洛克菲勒大學(xué)脊椎動(dòng)物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室將為VGP項(xiàng)目提供測(cè)序數(shù)據(jù)，該實(shí)驗(yàn)室主任Olivier Fedrigo表示，BioNano的圖譜平臺(tái)需要200Kb及以上的DNA片段，其他技術(shù)如PacBio和10x Genomics則可以獲取更短的DNA片段，但實(shí)驗(yàn)室決定采取一種適用于所有情況的DNA提取方法。DNA片段不僅要非常長(zhǎng)，還要非常純，不存在蛋白質(zhì)或其他污染物，這對(duì)納米孔測(cè)序尤為重要。

目前，該研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)決定使用Bionano的一種瓊脂糖凝膠提取試劑盒及方案，該方案可提取超過(guò)250Kb的DNA片段，適用于本所有的下游應(yīng)用，并適用于不同樣本類(lèi)型，包括動(dòng)物組織、血液、細(xì)胞系和植物。但問(wèn)題在于，該方案流程為7~10天，并且很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，產(chǎn)量不足以進(jìn)行PacBio測(cè)序，一旦開(kāi)始用于VGP的高通量基因組組裝就會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。因此研究團(tuán)隊(duì)必須調(diào)整Bionano的試劑盒，提高DNA產(chǎn)量。

從個(gè)體基因組中獲取長(zhǎng)片段DNA，是進(jìn)行基因組測(cè)序的關(guān)鍵。Bionano和Nanopore等公司獲取真正長(zhǎng)DNA片段信息主要依賴(lài)于DNA的高分子量提取。為了從人的細(xì)胞中提取納米孔測(cè)序用的長(zhǎng)片段DNA樣本，英國(guó)伯明翰大學(xué)Josh Quick研究員與同事使用了傳統(tǒng)的苯酚-氯方制備技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)沿用了數(shù)十年，可使DNA保持較高的濃度，并在一定程度保持DNA片段的長(zhǎng)度。但遺憾的是，這種方法同樣難以自動(dòng)化。人們往往喜歡談?wù)摣@得的長(zhǎng)read，但那只是為了吸引客戶(hù)，真正需要關(guān)心的N50。重要的是，獲得的長(zhǎng)片段DNA有多少是可用的？

多家公司已經(jīng)接受了這項(xiàng)挑戰(zhàn)，如Circulomics、Bionano、Sage Science和RevoluGen，其共同目的是開(kāi)發(fā)一種高通量方法，可從不同的樣品類(lèi)型中提取數(shù)百Kb和長(zhǎng)達(dá)Mb的DNA分子。此外，一些學(xué)術(shù)團(tuán)體也一直在開(kāi)發(fā)自用的提取方法，以滿(mǎn)足研究中的特定需求。下面，我們一起看看這些公司的研究進(jìn)展。

Bionano Genomics

Bionano 公司一直在開(kāi)發(fā)提取高質(zhì)量超高分子量DNA的方法。使用的是經(jīng)過(guò)多年研制的瓊脂糖凝膠化學(xué)試劑，并提供了有關(guān)DNA長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)。公司內(nèi)部和第三方合作伙伴都在努力開(kāi)發(fā)更快、更自動(dòng)化的樣本制備方法，并計(jì)劃在未來(lái)的幾個(gè)月內(nèi)發(fā)布新產(chǎn)品。

改進(jìn)樣品制備方法，首先要以保持DNA完整性的方式收集和儲(chǔ)存樣本。如果開(kāi)始使用的樣本就很差勁，也就無(wú)法提取高質(zhì)量的DNA。目前，Bionano已經(jīng)可提供用于冷凍和處理的哺乳動(dòng)物血液樣本的方案，并正在研究其他各種組織樣本的處理方案。

在DNA提取方面，Bionano正在投資不使用瓊脂糖凝膠的替代樣本制備方案和試劑盒，其速度更快且是自動(dòng)化的。據(jù)悉，該試劑盒可提取高純度的DNA，平均片段長(zhǎng)度為250Kb以上。同時(shí)，該公司正在研究新的解決方案和雜質(zhì)去除方法。目的是即在相同工作流程時(shí)間內(nèi)（幾小時(shí)內(nèi)），達(dá)到NGS測(cè)序的DNA提取標(biāo)準(zhǔn)。許多用戶(hù)會(huì)對(duì)快速且不需要貴重設(shè)備的提取試劑盒感到滿(mǎn)意，自動(dòng)化將有助于其擴(kuò)展到一次進(jìn)行更多樣本的檢測(cè)應(yīng)用。

Circulomics

Circulomics公司一直與Bionano合作開(kāi)發(fā)新的DNA提取技術(shù)。該公司開(kāi)發(fā)了一種Nanobind技術(shù)，其原理類(lèi)似于常規(guī)的磁珠提取DNA ，但該技術(shù)不會(huì)使用數(shù)百萬(wàn)的小顆粒，而是利用具有納米結(jié)構(gòu)二氧化硅表面的小磁盤(pán)與DNA結(jié)合，其表面會(huì)保護(hù)DNA不被剪切。在不同的儀器類(lèi)型中使用，Nanobind可在半小時(shí)內(nèi)處理12到96個(gè)樣本，可在1小時(shí)左右獲得數(shù)百Kb的DNA片段。Nanobind有一個(gè)自動(dòng)化版本，可在賽默飛世爾科技的KingFisher平臺(tái)運(yùn)行。

通常情況下，DNA分子必須被剪切到合適的尺寸才能更好的進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。Circulomics采用兩種策略，一種是使DNA長(zhǎng)達(dá)數(shù)百Kb，滿(mǎn)足長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序要求；另一種是為Bionano等應(yīng)用產(chǎn)生超高分子量的DNA，以適用于任何提取試劑盒。此外，Circulomics還在開(kāi)發(fā)DNA文庫(kù)制備純化方法，同樣使用納米磁盤(pán)作為提取工具，但使用不同的化學(xué)物質(zhì)去除短DNA片段、鹽或蛋白質(zhì)。

目前，Circulomics公司銷(xiāo)售兩種Nanobind DNA提取試劑盒：一種用于細(xì)胞、細(xì)菌或血液，另一種用于植物細(xì)胞核。此外，該公司正在利用研發(fā)中的試劑為不常見(jiàn)樣本提供定制化DNA提取服務(wù)。同時(shí)，Circulomics還在開(kāi)發(fā)一種用于組織DNA提取的商業(yè)試劑盒，可適用于多種生物和組織樣本。這將涉及一些特殊的同質(zhì)化步驟和雜質(zhì)去除方法，尚難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

Sage Science

2017年，Sage Science公司推出了一種用于提取高分子量DNA的儀器，名為Sage HLS。該系統(tǒng)采用電泳技術(shù)，每次多可處理四個(gè)樣本，包括細(xì)胞、細(xì)胞核或球形細(xì)胞的懸浮液。整個(gè)制備過(guò)程需要2~6小時(shí)，DNA可保持?jǐn)?shù)Mb大小，并纏繞在樣本的瓊脂糖壁中。在加入非特異性酶或CRISPR/Cas9復(fù)合物后，DNA被切割，并分離純化。

Sage Science方面表示，Sage HLS的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)就是，DNA分子不會(huì)暴露在粘滯剪切下，因此可以分離出非常高分子量的DNA，大小可達(dá)2Mb。此外，研究人員已經(jīng)在利用Cas介導(dǎo)的系統(tǒng)分離50~400Kb之間的DNA片段，并正努力將范圍增大到1Mb。

RevoluGen

英國(guó)的RevoluGen是另一家致力于開(kāi)發(fā)高分子量DNA提取新方法的公司。該公司開(kāi)發(fā)了一種名為Fire Monkey的自旋柱試劑盒，其使用的專(zhuān)有技術(shù)可確保DNA保持完整，工作流程約為1小時(shí)。

RevoluGen方面表示，依賴(lài)*的溶液和基質(zhì)化學(xué)成分，在任何環(huán)節(jié)都不會(huì)像其他自旋柱試劑盒那樣破壞DNA。Fire Monkey獲得的DNA尺寸高達(dá)500 Kb，如果是新鮮樣本，平均片段大小可大于100 Kb。此外，與其他方法提取的DNA相比，該方法獲得的DNA具有較少的缺口，可減少對(duì)長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的干擾。

Fire Monkey可以被復(fù)用，處理樣本數(shù)量幾乎不受限制。此外，該方法也可通過(guò)磁珠技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，目前該公司尚未進(jìn)行相關(guān)工作。實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的一個(gè)挑戰(zhàn)就是，DNA往往長(zhǎng)、短片段混合在一起。為了解決這一問(wèn)題，RevoluGen開(kāi)發(fā)了一種名為Fire Flow的DNA大小分離技術(shù)，可在文庫(kù)制備過(guò)程中去除10Kb及以下的DNA片段。

參考資料：

DNA Extraction Remains Bottleneck for Long-Read Techs But Solutions Begin to Emerge