cosmobiousa高質(zhì)量抗人類四跨膜蛋白單克隆

用抗人類四跨膜蛋白單克隆抗體和OptiPrep™進行外顯子的

分離和鑒定

什么是外泌體？

細胞外囊泡（EV；包括經(jīng)典的外泌體，非經(jīng)典的外泌體，微囊泡，大的脂質(zhì)體，凋亡小體，凋亡小泡，自噬性細胞外小泡，兩性小體和ARRM）是釋放到細胞外環(huán)境中的40-1000 nm的膜小泡。和來自大多數(shù)細胞類型的體液，包括紅細胞，血小板，淋巴細胞，樹突狀細胞，內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞。這些囊泡根據(jù)其分泌機制分為兩種。因此，經(jīng)典囊泡在多囊泡內(nèi)體中形成，而微囊泡則是從質(zhì)膜上直接出芽而形成的。盡管經(jīng)典外泌體成分因其起源的細胞類型而異，但無論它們的起源如何，似乎都可能共享某些分子。這些分子包括四跨膜蛋白（CD9，CD63和CD81），它們被認為是經(jīng)典外泌體生物發(fā)生機制的重要組成部分。因此，研究人員已使用CD9，CD63和CD81來分離和表征經(jīng)典外泌體制劑的純度。

在過去的十年中，外泌體作為microRNA（miRNA）載體，疾病生物標(biāo)志物和潛在的治療性藥物傳遞載體成為人們關(guān)注的焦點。盡管外泌體很重要，但它們的分離和鑒定仍然被認為是重大的科學(xué)挑戰(zhàn)，特別是在轉(zhuǎn)化為臨床需求時。通常，外泌體和其他電動汽車已通過超速離心純化。技術(shù)挑戰(zhàn)，時間和成本已導(dǎo)致替代提純方法的泛濫，其中許多現(xiàn)在可商購獲得。雖然據(jù)報道外泌體含量包括基因組DNA，RNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)， 

近的地標(biāo)性論文（杰普森·D。，菲尼克斯·A。，富蘭克林·J。希金博特姆·J。，張Q.，齊默曼·L。利勃勒·D。，平·J。，劉Q. Evans，R.，F(xiàn)issell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌體組成細胞的重新評估177（2），428-445.e18。）結(jié)果表明，大多數(shù)外泌體分離方法（包括經(jīng)典的超速離心分離法）都受到來自非囊泡細胞外來源的大量蛋白質(zhì)和DNA污染的困擾。揭示這種令人驚訝的污染水平的方法包括高分辨率碘克沙醇密度梯度超速離心[將小型EV與非囊泡成分（如穹ault和外泌體）分離）以及使用抗體從人血漿和細胞條件培養(yǎng)基中直接免疫捕獲（DIC）至四跨膜蛋白分子CD63，CD9或CD81。

  高質(zhì)量抗人類四跨膜蛋白單克隆

冷凍電子顯微鏡檢測與抗人CD63抗體結(jié)合的外泌體（克隆8A12）。
將外泌體和抗人CD63抗體（克隆8A12）混合并用冷凍電子顯微鏡（Titan Krios）成像。顯示的是外泌體（A）的低溫電子顯微照片，利用單結(jié)合抗體（青色）對外泌體（綠色）進行的三維重建（B），以及外泌體和結(jié)合抗體的旋轉(zhuǎn)3D層析成像重建（宜）。圖片由沖繩蛋白質(zhì)斷層掃描有限公司提供。 

來自CosmoBio USA的高特異性抗人四跨膜蛋白抗體是使用新型“超凈”方法表征和分離經(jīng)典外泌體的理想試劑。

* Tide Fluor™2（TF2）的光譜特性與熒光素和AlexaFluor®488（Invitrogen）相似。與熒光素相比，TF2具有更強的熒光和更高的光穩(wěn)定性。另外，它的熒光在pH 3到11之間與pH無關(guān)。與FITC標(biāo)記的抗體相比，TF2標(biāo)記的抗體顯示出更強的熒光和更高的光穩(wěn)定性。這些特性使TF2成為熒光素的替代品。 
＃Tide Fluor™5（TF5）具有與Cy5相同的光譜特性。與Cy5相比，TF5具有更強的熒光性和更高的光穩(wěn)定性。此外，其熒光在pH 3至11之間與pH無關(guān)。與Cy5標(biāo)記的抗體相比，TF5標(biāo)記的抗體顯示出更強的熒光和更高的光穩(wěn)定性。這些特性使TF5成為Cy5的替代品。 

具有四跨膜蛋白抗體的經(jīng)典外來體的超凈直接免疫親和捕獲（DIC）

收集后立即將細胞條件培養(yǎng)基在4℃下分別以400× g，2,000× g和15,000× g進行離心分離。將上清液通過0.22mm孔的PES過濾器（Millipore）過濾以產(chǎn)生預(yù)先澄清的培養(yǎng)基。隨后的所有步驟也都在4°C下進行。如上所述，直接從人血漿中提取外來體的DIC，不同的是在這些情況下，上清液是未經(jīng)處理，未經(jīng)稀釋和未經(jīng)過濾的血漿（兩輪3000 x g產(chǎn)生離心15分鐘）。將預(yù)先清除的培養(yǎng)基分為三種方式：將一部分與直接與針對CD63，CD81或CD9的抗體綴合的磁珠一起孵育；將第二部分與綴合有小鼠IgG的磁珠一起溫育，并允許溫育并進行章動和旋轉(zhuǎn)16小時。將第三部分進行超速離心和洗滌以產(chǎn)生粗制的sEV沉淀物（P120）。孵育后，將珠子在冰冷的0.1％BSA-PBS（pH 7.4，通過0.22mm膜過濾）中洗滌四次，后，在PBS pH 7.4（pH 7.4，通過0.22mm膜過濾）中洗滌一次。 ）。后一次洗滌后，立即將負載有外泌體的珠子重新懸浮在細胞裂解緩沖液和LDS樣品緩沖液中，在冰上放置30分鐘，然后重懸于LDS樣品緩沖液中，然后加熱至70°C 10分鐘以釋放蛋白質(zhì)。通過使用磁鐵從懸浮液中除去珠子，并將澄清的裂解物用于免疫印跡分析。在某些情況下，在后的洗滌步驟之后，立即將裝載了外來體的珠子裂解以提取DNA。 
（摘自：耶普森D.，菲尼克斯A.，富蘭克林J.，希金博瑟姆J.張Q.齊默曼L.利勃勒D.平J.劉Q.埃文斯R.，F(xiàn)issell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌體組成細胞的重新評估177（2），428-445.e18。） 單擊此處

ExoTrap™旋轉(zhuǎn)柱

CosmoBio USA的ExoTrap™外泌體分離旋轉(zhuǎn)柱試劑盒使用旋轉(zhuǎn)柱固定的抗人CD9抗體（克隆12A12）捕獲外泌體?？梢栽?0分鐘內(nèi)從人血清，血漿，唾液，尿液和培養(yǎng)上清液中分離出外來體來源的蛋白質(zhì)和微RNA。 特征：

• 從血清，血漿，尿液，唾液，培養(yǎng)上清液中回收外泌體
• 30分鐘內(nèi)高純度外泌體
• 旋轉(zhuǎn)柱操作簡單

實驗實例 
使用ExoTrap™外泌體在50ul SDS樣品緩沖液中回收。通過蛋白質(zhì)印跡分析外泌體標(biāo)志物表達。 圖1.從培養(yǎng)上清液中分離外來體。用抗-CD9（克隆12A12），抗-CD63（克隆8A12）和抗-CD81（克隆12C4）探測293T細胞培養(yǎng)上清液和MKN7細胞培養(yǎng)上清液（20ul /泳道）。圖2.從人血漿中分離外來體。用抗CD9（克隆12A12）探測EDTA處理的人血漿（20ul /泳道）。






 

OptiPrep™（碘克沙醇

純化外泌體的宜密度梯度培養(yǎng)基

OptiPrep™是60％碘克沙醇在水中的無菌內(nèi)毒素測試溶液，密度為1.32 g / ml。 


碘克沙醇是作為X射線造影劑開發(fā)的，因此已經(jīng)進行了嚴格的臨床測試。它是非離子性的，對細胞無毒并且在代謝上是惰性的。碘克沙醇溶液可以在所有有用的密度下制成等滲的。碘克沙醇溶液的粘度和重量克分子滲透壓濃度低。 

Optiprep™使用高分辨率密度梯度超速離心技術(shù)進行外來體純化

高分辨率（12％–36％）碘克沙醇密度梯度分級分離膜封閉的sEV與非囊泡（NV）組分將 OptiPrep™（碘克沙醇）密度介質(zhì)在冰冷的PBS中立即制備，然后用于產(chǎn)生不連續(xù)步驟（12 ％–36％）的漸變。將sEV的粗顆粒（P120）重懸于冰冷的PBS中，并與冰冷的碘克沙醇/ PBS混合，制成終的36％碘克沙醇溶液。將懸浮液添加到離心管的底部，將碘克沙醇濃度遞減的PBS溶液小心地鋪在頂部，產(chǎn)生完整的梯度。以相同的方式生成沒有樣品的相同梯度，以用于稍后確定餾分密度。底部負載的12％–36％梯度在120,000 x下進行超速離心
g下使用SW41 TI擺動鏟斗轉(zhuǎn)子（k因子124，貝克曼庫爾特）在4°C下放置15h。從梯度的頂部收集了12個1 mL的餾分。使用折射計（ATAGO，東京，日本）從重復(fù)的梯度測量分數(shù)密度。對于納米顆粒跟蹤分析（NTA），將級分合并并在無顆粒PBS中稀釋。為了進行免疫印跡，將每個單獨的1 mL餾分轉(zhuǎn)移到新的超速離心管中，在PBS中稀釋12倍，然后以120,000 x g的速度進行超速離心使用SW41 TI擺動鏟斗轉(zhuǎn)子在4°C下放置4h。將所得沉淀在冰上的細胞裂解緩沖液中裂解30分鐘。對于RNA和DNA提取，將級分合并，轉(zhuǎn)移至新的超速離心管中，在PBS中稀釋約6倍，并使用SW 32 Ti擺動桶轉(zhuǎn)子在4°C下于120,000 x g進行超速離心4小時。 （摘自：耶普森D.，菲尼克斯A.，富蘭克林J.，希金博瑟姆J.張Q.齊默曼L.利勃勒D.平J.劉Q.埃文斯R.，F(xiàn)issell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌體組成細胞的重新評估177（2），428-445.e18。）

Optiprep™應(yīng)用說明

1. 條件培養(yǎng)基中的哺乳動物細胞外泌體和其他微泡
2. 來自非哺乳動物來源的細胞外囊泡
3. 細胞內(nèi)外囊泡運輸和囊外復(fù)合物-方法學(xué)概述
4. 制備突觸小體，突觸小體，神經(jīng)黑色素顆粒和突觸小泡–方法學(xué)調(diào)查
5. 從各種來源分離水泡和顆粒部分

用戶報告

四跨素抗體

西田青樹（Nao Nishida-Aoki） 
國家癌癥中心分子與細胞治療研究所

實驗發(fā)現(xiàn)

外泌體是脂質(zhì)雙層限定的直徑約100nm的囊泡。癌細胞通過分泌促進癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的外來體，對周圍細胞產(chǎn)生不利影響。我們想知道抑制癌細胞來源的外泌體功能是否會抑制癌癥轉(zhuǎn)移。為此，我們使用了與外泌體結(jié)合的抗體來抑制源自癌細胞的外泌體的作用。

尋找能識別人乳腺癌細胞外來體的抗體用于具有人乳腺癌細胞的小鼠異種移植模型。首先，我們要檢查抗人CD9和抗人CD63是否會結(jié)合到從乳腺癌細胞條件培養(yǎng)基分離的外泌體表面。外泌體的小尺寸阻止了常規(guī)顯微鏡的使用。因此，有必要采用免疫電子顯微鏡。但是，免疫電子顯微鏡具有挑戰(zhàn)性，需要與靶標(biāo)結(jié)合良好的抗體。

抗人CD9（克隆12A12）和抗人CD63（克隆8A12）在免疫沉淀方面具有良好的記錄，因此有望在免疫電子顯微鏡中進行測試。這些試劑很容易檢測到CD63。但是，檢測CD9之前，需要進行實質(zhì)性修改，才能成功染色（圖1）。另外，出于該實驗的目的，重要的是所選抗體對人類而非小鼠具有*的特異性，以防止毒性和脫靶效應(yīng)。在蛋白質(zhì)印跡實驗中發(fā)現(xiàn)該抗體具有非常強的人特異性，可以輕松檢測到來自人而非小鼠的CD9和CD63（圖2）。

建立了兩種抗體的檢測方案和人類特異性后，有可能進行體內(nèi)研究。在乳腺癌的鼠異種移植模型中施用抗人CD9（克隆12A12）和抗人CD63（克隆8A12），以確定是否有可能抑制轉(zhuǎn)移。在此模型中，我們能夠成功抑制癌癥轉(zhuǎn)移（參考文獻1）。我們認為該實驗的成功*歸因于我們使用的高質(zhì)量抗體。我希望這些抗體能夠幫助更多的人進行研究。

數(shù)字

圖1.免疫電子顯微鏡檢測外泌體表面上的人CD9和CD63蛋白 
（A）抗人CD9抗體（克隆12A12）在人乳腺癌細胞的外泌體表面上檢測到CD9。（B）抗人CD63抗體（克隆8A12）還在人乳腺癌細胞的外泌體表面檢測到CD63。 圖2.人類和小鼠CD9和CD63蛋白的蛋白質(zhì)印跡法使用 抗人類CD9抗體（克隆12A12），抗人類CD63抗體（克隆8A12），抗小鼠CD9抗體和抗小鼠CD63抗體來探測含有來自人乳腺癌細胞系（MDA-MB-231-lucD3H2LN）和鼠類乳腺癌細胞系（4T1-luc）的裂解物。

參考文獻

1. 西田青木（Nishida-Aoki，N.），富永（N. Tominaga），竹下（F.Takeshita），園田H. （2017）循環(huán)中的細胞外囊泡破壞作為一種針對癌癥轉(zhuǎn)移的新型治療策略，Mol Ther，25：181-91。

小坂伸吉國立 
癌中心
分子細胞治療研究所

實驗發(fā)現(xiàn)

外泌體是直徑約100 nm的小細胞外分泌脂質(zhì)雙層分隔的囊泡。ISEV（細胞外囊泡學(xué)會）建議使用術(shù)語細胞外囊泡（EVs）來指代分泌性囊泡的異質(zhì)類，其中包括衍生自多囊泡內(nèi)體的囊泡。近的外泌體研究已經(jīng)開始闡明外泌體在某些疾病中的作用。但是，要了解外泌體的產(chǎn)生機理，必須具有：1）生理學(xué)上了解外泌體的作用；2）了解外泌體引起的疾病。闡明癌細胞外泌體分泌的機制可能導(dǎo)致新的癌癥治療方法。

為了追蹤外泌體產(chǎn)生的動力學(xué)，我們使用抗人CD63抗體（克隆8A12；可從Cosmo Bio USA獲得）進行免疫染色實驗。使用免疫熒光顯微鏡，我們在前列腺癌細胞系PC-3M（圖1）和結(jié)腸癌細胞系HCT116（圖2）中觀察到許多CD63陽性顆粒樣結(jié)構(gòu)。將來，我們將癌細胞與抗人CD63抗體（克隆8A12）和其他內(nèi)體標(biāo)記物抗體共同染色，以探索癌細胞產(chǎn)生外泌體的能力?？谷薈D63抗體（克隆8A12）的高特異性使其可以成功用于體內(nèi)靶向外泌體以抑制癌癥轉(zhuǎn)移。

數(shù)字

圖1. CD63在前列腺癌細胞系PC-3M中的 
定位通過Alexa Fluor™488標(biāo)記的抗小鼠二抗檢測到抗人CD63抗體（克隆8A12）。 圖2. CD63在結(jié)腸癌細胞系HCT116中的定位通過Alexa Fluor™488標(biāo)記的抗小鼠二抗檢測到抗人CD63抗體（克隆8A12）



 

吉岡雄介 
國立癌癥中心研究所

實驗發(fā)現(xiàn)

1975年，喬治·科勒（George Kohler）和塞薩爾·米爾斯坦（CésarMilstein）發(fā)明了單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)，并因此在1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。單克隆抗體*改變了制藥業(yè)，為新型診斷和靶向療法打開了大門。它不僅有益于醫(yī)學(xué)實踐，也有益于基礎(chǔ)研究。并非所有的單克隆抗體都等效。對于每種特定的應(yīng)用，識別“好”抗體很重要。通常，“好”抗體是識別單個分子并與其分子靶標(biāo)牢固結(jié)合的抗體。

在外泌體研究中獲得“良好抗體”尤為重要。外泌體是脂質(zhì)雙層分隔的囊泡，直徑約100 nm，在其管腔和膜中含有各種蛋白質(zhì)。使用免疫電子顯微鏡，免疫印跡，ELISA，免疫沉淀和免疫親和柱，已使用抗體來檢測和分離體液或培養(yǎng)上清液中的外泌體。這些應(yīng)用需要“優(yōu)質(zhì)”抗體。

由于外泌體是異質(zhì)的，因此根據(jù)其來源，它們可能會展示并包含不同的分子。但是，蛋白質(zhì)的一個子集很可能在不同類型的外泌體之間共享。目前，好的泛外泌體標(biāo)記是四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81。我的外泌體研究始于構(gòu)建外泌體檢測系統(tǒng)的目標(biāo)。我努力尋找在我的檢測系統(tǒng)中識別外泌體標(biāo)記的單克隆抗體。盡管我嘗試了許多克隆，但直到發(fā)現(xiàn)抗CD9（克隆12A12）和抗CD63（克隆8A12）（圖1和參考2），我都沒有獲得好的結(jié)果。這些抗體在蛋白質(zhì)印跡（圖2）和免疫電子顯微鏡中表現(xiàn)良好。這些抗體的人類特異性由其無法檢測小鼠CD9和小鼠CD63證實。該特性在小鼠的人異種移植模型系統(tǒng)中很有用，在這種系統(tǒng)中，抗體不會與內(nèi)源性CD9和CD63反應(yīng)。如果在檢測人外泌體時遇到問題，則抗CD9（克隆12A12）和抗CD63（克隆8A12）抗體可能會有用。

數(shù)字

圖1.克隆12A12（抗CD9）和8A12（抗CD63）相對于競爭對手克隆A和B的ELISA性能。 圖2.克隆8A12（抗CD63）和12A12（抗CD9）的免疫印跡性能人類外泌體。

參考文獻

1. 吉岡Y等。（2013）J Extracell Vesicles ，2：20424
2. 吉岡Y等。（2014）Nat Commun，5：3591

高橋彰子 
癌癥研究基金會

實驗發(fā)現(xiàn)

外來體通過ESCRT復(fù)合物的作用從多囊泡內(nèi)體中包含的囊泡中產(chǎn)生。這些腔內(nèi)囊泡被分泌為直徑為50-150nm的細胞外囊泡。近來，隨著外泌體包含蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和核酸的發(fā)現(xiàn)，許多注意力集中在它們作為細胞間通訊載體的功能上。

我們正在分析衰老相關(guān)的分泌表型，其部分特征是炎癥細胞因子和趨化因子的分泌增加。衰老細胞還提高了外泌體的分泌（參考文獻1）。我們通過正常人成纖維細胞的連續(xù)傳代（復(fù)制性衰老）和引入激活的癌基因RasV12（癌基因誘導(dǎo)的衰老）來誘導(dǎo)細胞衰老。溫育48小時后，通過超速離心回收條件培養(yǎng)基中的外來體?；厥盏募毎馕镔|(zhì)的大小分布通過納米顆粒跟蹤分析進行表征。衰老細胞中分泌的外泌體的數(shù)量是年輕細胞的30??至50倍（圖1，頂部）。為了進一步比較衰老與年輕外來體，我們使用抗人CD81單克隆抗體（克隆12C4，以1：1000稀釋度使用；來自Cosmo Bio USA）進行了蛋白質(zhì)印跡實驗。結(jié)果表明，從衰老中回收的CD81蛋白量相對于年輕外來體有所增加（圖1，底部）。還觀察到從衰老細胞中回收的外泌體對MCF-7乳腺癌細胞具有促進生長的作用（參考文獻2）。

外泌體的生理作用和診斷/治療潛力仍未*了解。我們正在分析正常細胞和衰老細胞分泌外泌體的詳細分子機制，以期闡明外泌體的生物學(xué)意義。此外，通過研究衰老 

數(shù)字

人類成纖維細胞TIG-3細胞年輕和衰老版本的外泌體分析（來自參考文獻1）。
上圖：通過NTA（納米粒子跟蹤分析）確定的回收的外泌體的相對數(shù)量。下圖：外泌體標(biāo)記蛋白的蛋白質(zhì)印跡檢測。

參考文獻

1. Takahashi，A.等。外泌體通過從細胞中排出有害DNA來維持細胞穩(wěn)態(tài)。納特COMMUN 8，15287（2017）。
2. 高杉，M。等。衰老細胞分泌的小細胞外囊泡通過EphA2促進癌細胞增殖。納特COMMUN 8，15729（2017）

EXOTRAP™外來體分離離心柱套件

名古屋大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科
病毒學(xué)
研究科佐藤佳隆

實驗發(fā)現(xiàn)

外泌體是膜包裹的30至100 nm的囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)和核酸，并由各種細胞分泌。通過獲取循環(huán)的通路，它們可以將信號傳輸?shù)竭h處的小區(qū)。已經(jīng)觀察到，通過外來體的細胞間通訊與抗原呈遞，細胞凋亡，炎癥，腫瘤進展和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。預(yù)計外泌體將在各個領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，例如在藥物輸送系統(tǒng)的開發(fā)中。

我們對病毒感染的細胞與附近未感染的細胞之間的相互作用感興趣。當(dāng)病毒感染的細胞與未感染的細胞混合培養(yǎng)后，熒光免疫染色可以檢測未感染細胞中的病毒蛋白，呈點狀信號。從這個發(fā)現(xiàn)，我對作為細胞間通訊介體的外泌體產(chǎn)生了興趣。

由于涉及冗長而困難的方法（傳統(tǒng)上包括超速離心），因此比較從各種來源和在不同條件下回收的外泌體具有挑戰(zhàn)性。因此，從操作簡便（任何人都可以純化），純化時間（可以在短時間內(nèi)完成純化）和應(yīng)用的多功能性（可以分析外泌體本身以及所含蛋白質(zhì)和核酸）的角度出發(fā)，我們進行了商業(yè)化探索可用的外泌體純化試劑盒，發(fā)現(xiàn)CosmoBio USA的“ ExoTrap™外泌體分離旋轉(zhuǎn)柱試劑盒”是理想的純化解決方案。

ExoTrap™的優(yōu)勢在于，可以在僅30分鐘的“短時間內(nèi)”從少量樣品中純化外泌體。作為外泌體研究的初學(xué)者，ExoTrap™使我能夠通過蛋白質(zhì)印跡法檢測與在純化前培養(yǎng)上清液中無法檢測到的外泌體相關(guān)的病毒蛋白。而且，我能夠證明在從外泌體抑制劑（GW4869）處理過的細胞的培養(yǎng)上清液中回收的ExoTrap™純化的外泌體中未檢測到病毒蛋白（1）。盡管ExoTrap™可能不適合廉價地純化大量外泌體，但強烈建議從小體積快速簡便地純化外泌體。 

數(shù)字

圖1.外泌體純化之前和之后以及用外泌體抑制劑處理之前和之后的
Western印跡（A）Western印跡顯示“ ExoTrap™外泌體分離旋轉(zhuǎn)柱試劑盒”純化的外泌體中LMP1和Hsp70的表達。
（B）Western印跡顯示“ ExoTrap™外來體分離旋轉(zhuǎn)柱試劑盒”純化的外來體中LMP1和Hsp70的表達，這些細胞來自用或未用外來體抑制劑（GW4869）處理的細胞培養(yǎng)上清液。

參考文獻

1. Sato et al。，Oncotarget，8; 39345-39355、2017年

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