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上海起發(fā)INCYTO C-WellTM技術(shù)指南

更新時(shí)間:2021-02-24      點(diǎn)擊次數(shù):1179

上海起發(fā)INCYTO C-WellTM技術(shù)指南

使用INCYTO C-WellTM的通用、高通量和大小可控的細(xì)胞球體培養(yǎng)方案

一般信息

本指南的目的:

C-WellTM技術(shù)指南包含有關(guān)C-WellTM細(xì)胞球體培養(yǎng)平臺(tái)的信息。本指南提供了球體形成和試劑制備的完整方案。

儲(chǔ)存和有效期:

室溫下儲(chǔ)存時(shí),C-WellTM的有效期為36個(gè)月。

不要重復(fù)使用,否則會(huì)遇到以下問(wèn)題:污染、細(xì)胞球體形成失敗和富含蛋白質(zhì)的表面。

請(qǐng)勿將C-WellTM儲(chǔ)存在紫外線輻射環(huán)境中。

預(yù)期用途:

僅供研究使用。不適用于人類(lèi)或動(dòng)物的診斷或治療用途。

 

C孔描述TM

C-WellTM:

C-WellTM是一個(gè)革命性的細(xì)胞球體培養(yǎng)平臺(tái),以高通量的方式生成各種類(lèi)型的尺寸控制的細(xì)胞球體。使用培養(yǎng)細(xì)胞球體的技術(shù)是一種懸滴法。

每個(gè)懸滴中的環(huán)境聚集細(xì)胞,然后形成單個(gè)球體。但懸滴法有幾個(gè)局限性。懸滴法的主要局限性是:“勞動(dòng)強(qiáng)度”、“低通量”、“培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較短”、“無(wú)法獲得額外的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基”和“細(xì)胞球體大小不均勻”。

與懸滴法相比,C-WellTM具有以下優(yōu)勢(shì)

任何其他商業(yè)化球體培養(yǎng)平臺(tái):“由于易于獲得培養(yǎng)基更換,延長(zhǎng)培養(yǎng)期10-30天”、“通過(guò)控制細(xì)胞接種密度,某些應(yīng)用的培養(yǎng)期極短,為2-3天”、“無(wú)直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸的共培養(yǎng)準(zhǔn)備系統(tǒng),例如Transwell小室”、“生成尺寸受控的細(xì)胞球體”、“由于無(wú)剪切應(yīng)力結(jié)構(gòu),易于改變裝置中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基”、“適用于各種細(xì)胞類(lèi)型”和“無(wú)限通量(一個(gè)裝置可獲得361個(gè)細(xì)胞球體)”。

 

方法

使用C孔制備用于細(xì)胞球體培養(yǎng)的試劑和材料TM

  • 靶細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基
  • 胰蛋白酶/EDTA或ACCUTASETM
  • 臺(tái)盼藍(lán)
  • 磷酸鹽緩沖液(PBS)1X
  • 70%乙醇
  • 100%乙醇
  • 去離子水(DDW),可選
  • 牛血清白蛋白(BSA)4%溶液,可選

使用C孔制備細(xì)胞球體培養(yǎng)設(shè)備TM

  • C-WellTM
  • 錐形管(15 mL或50 mL)
  • T75燒瓶或細(xì)胞培養(yǎng)皿
  • 細(xì)胞過(guò)濾器(100 μm孔徑)
  • 皮氏培養(yǎng)皿(60 mm或100 mm,未處理)
  • 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(例如DHC-N01、INCYTO)
  • 移液器和吸頭(1 mL和200 μL)
  • 血清移液器及吸頭(10 mL)
  • 潔凈工作臺(tái)
  • CO2培養(yǎng)箱
  • 相差顯微鏡檢查
  • 吸引器
  • 離心機(jī)
  • 酒精燈

A. C孔預(yù)處理TM 細(xì)胞接種前

  1. 將生長(zhǎng)培養(yǎng)基、1X PBS(或DDW)和100%乙醇加熱至室溫。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基的推薦近似體積為14 mL/1器械,1X PBS為24 mL/1器械,100%乙醇為8 mL/1器械。

  1. 在超凈工作臺(tái)中拆除C-WellTM的包裝。
  2. 使用無(wú)菌鑷子,從一個(gè)外緣朝向另一個(gè)外緣將C-WellTM置于60 mm培養(yǎng)皿上,以防止C-WellTM和培養(yǎng)皿之間產(chǎn)生氣泡。
  3. 向制備的平皿中加入8 mL 100%乙醇。
  4. 用1 mL移液器反復(fù)移液,輕輕去除微孔中的氣泡。
  5. 在培養(yǎng)皿一角抽吸100%乙醇。請(qǐng)勿在每個(gè)微孔中抽吸溶液。
  6. 向培養(yǎng)皿中加入8 mL 1X PBS,再次去除氣泡。
  7. 在培養(yǎng)皿一角抽吸1X PBS。請(qǐng)勿在每個(gè)微孔中抽吸溶液。
  8. 重復(fù)上述7、8步兩次。
  9. 向培養(yǎng)皿中加入7 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基,并充分去除氣泡。
  10. 將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中至少24小時(shí)。
  11. 用1 mL移液器反復(fù)移液,輕輕去除微孔中的氣泡。
  12. 在培養(yǎng)皿一角吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基,并在細(xì)胞接種前加入7 mL新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

B-1.靶細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備(貼壁細(xì)胞用)

  1. 將生長(zhǎng)培養(yǎng)基和適當(dāng)濃度的胰蛋白酶/EDTA溶液預(yù)熱至37 ℃。
  2. 加入10 mL 1X PBS,輕輕清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T75)或培養(yǎng)皿(100 mm)。
  3. 吸取1X PBS溶液。
  4. 加入2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液,并將燒瓶置于37℃CO2培養(yǎng)箱中1 ~ 2 min(取決于細(xì)胞類(lèi)型)。
  5. 輕輕敲擊燒瓶,觀察細(xì)胞。大部分細(xì)胞應(yīng)分離
  6. 用4 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基或適當(dāng)?shù)闹泻腿芤褐泻鸵鹊鞍酌?EDTA處理的細(xì)胞懸液。
  7. 通過(guò)反復(fù)移液*分離細(xì)胞。
  8. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量(例如INCYTO C-Chip、DHC-N01)
  9. 在適當(dāng)離心力下離心細(xì)胞懸液。
  10. 通過(guò)抽吸去除上清液。
  11. 將細(xì)胞團(tuán)塊重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。細(xì)胞懸液的終接種密度和終體積應(yīng)分別為0.1 ~ 0.5 × 106個(gè)/mL和7 mL。這些值因細(xì)胞類(lèi)型而異。

 

B-2.靶細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備(用于懸浮細(xì)胞)

  1. 將生長(zhǎng)培養(yǎng)基和適當(dāng)濃度的胰蛋白酶/EDTA溶液(可選)加熱至37 ℃。
  2. 通過(guò)反復(fù)移液使細(xì)胞懸液均質(zhì)化并解聚。
  3. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量(例如INCYTO C-Chip、DHC-N01)
  4. 在適當(dāng)離心力下離心細(xì)胞懸液。
  5. 通過(guò)抽吸去除上清液。
  6. (可選)加入1 ~ 2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液,置于37 °C CO2培養(yǎng)箱中1 ~ 2 min(細(xì)胞類(lèi)型不同)。
  7. (可選)用2 ~ 4 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基或適當(dāng)?shù)闹泻腿芤褐泻鸵鹊鞍酌?EDTA處理的細(xì)胞懸液(因細(xì)胞類(lèi)型而異)。
  8. (可選)在適當(dāng)離心力下離心細(xì)胞懸液。
  9. (可選)通過(guò)抽吸去除上清液。
  10. 將細(xì)胞團(tuán)塊重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。細(xì)胞懸液的終接種密度和終體積應(yīng)分別為0.1 ~ 0.5 × 106個(gè)/mL和7 mL。這些值因細(xì)胞類(lèi)型而異。

 

  1. 使用C-Well形成細(xì)胞球體TM
    1. 將生長(zhǎng)培養(yǎng)基加熱至37 ℃。
    2. 用1 mL移液器反復(fù)移液,輕輕去除微孔中的氣泡。
    3. 吸出培養(yǎng)皿一角的生長(zhǎng)培養(yǎng)基,加入7 mL細(xì)胞接種密度為0.1 ~ 0.5 × 106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液
    4. 10 ~ 15 min后(因細(xì)胞類(lèi)型而異),輕輕吸出細(xì)胞懸液,除去上清液細(xì)胞。
    5. 在培養(yǎng)皿一角加入7 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
    6. 吸出混懸液,并在培養(yǎng)皿一角加入7 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基。重復(fù)該步驟兩次。確保該步驟結(jié)束時(shí)沒(méi)有懸浮細(xì)胞是非常重要的。如果不是,這些懸浮細(xì)胞可能阻礙細(xì)胞球體的形成。
    7. 培養(yǎng)皿置37 °C CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
    8. 每24小時(shí)更換一次培養(yǎng)皿中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
 
 

圖1 MCF7球體的培養(yǎng)條件。細(xì)胞接種密度和清洗時(shí)間因細(xì)胞類(lèi)型而異。應(yīng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)慕臃N密度和洗滌時(shí)間。


 

 

圖2 MCF7球體的形成。

 

 

 

圖3 A549球體的形成。

 

 

圖4 HepG2球體的形成。

 

 

圖5小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(mNSC)球體的形成。與其他傳統(tǒng)的球體培養(yǎng)方法相比,C-WellTM可以生成尺寸控制、形狀均勻的細(xì)胞球體。

  1. 從C孔中分離細(xì)胞球體TM
    1. 將生長(zhǎng)培養(yǎng)基加熱至37 ℃。
    2. 用移液器直接吸取(帶1 mL吸頭)生長(zhǎng)培養(yǎng)基至C-WellTM上。
    3. 重復(fù)上述步驟2,直至收集到大部分細(xì)胞球體。
    4. 輕輕移取細(xì)胞球體溶液。
    5. 將溶液添加到細(xì)胞過(guò)濾器的一個(gè)表面(頂部)。
    6. 翻轉(zhuǎn)濾網(wǎng),并將生長(zhǎng)培養(yǎng)基添加到濾網(wǎng)的另一面(底部)。
    7. 將細(xì)胞球體鋪板于未經(jīng)處理的培養(yǎng)皿中。
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