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如何降低ELISA的背景

更新時(shí)間:2013-10-16      點(diǎn)擊次數(shù):2085

ELISA實(shí)驗(yàn)的原理似乎很 簡單,不外乎固定抗原,添加一抗、二抗和底物,間中夾雜著洗滌和封閉。然而,即使是平淡無奇的洗滌和封閉,如果做得不太好,也有可能毀了整個(gè)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn) 結(jié)束時(shí),我們是否能獲得有意義的信息,這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比。背景噪音會(huì)影響您對結(jié)果的判斷。如何降低ELISA的背景,下面有一些 tips。

洗滌很重要

洗滌步驟看似很無聊,其實(shí)很重要,因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中,那么它會(huì)增加背景噪音。如有必要,可增加洗滌液中的鹽濃度,這會(huì)阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果背景過高,而您懷疑洗滌不夠時(shí),可以嘗試增加洗滌次數(shù)。

 

封閉更關(guān)鍵

封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號(hào)的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過高,懷疑封閉不充分,那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,或適當(dāng)延長封閉時(shí)間。

如果您一直被背景問題所困擾,那么也許您該花些時(shí)間來優(yōu)化封閉液。這可能需要時(shí)間,但也 是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液:蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個(gè)因素,包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。 好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合,但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。

zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定,在去除洗滌過程中的 一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用,因?yàn)楹苋菀妆幌吹?。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為 0.01-0.1%),它會(huì)降低特異結(jié)合,產(chǎn)生假陰性。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉。

蛋白封閉液則有所不同,是*的。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗 原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不 過,它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個(gè)問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清。

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抗體濃度須優(yōu)化

我們通常會(huì)依照師兄師姐留下來的操作步驟,但是如果試劑稍有不同,則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住,非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景。為了防止這一點(diǎn),切勿使用過多的一抗或二抗。

 

檢測試劑要適量

另一點(diǎn)也很顯而易見:切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高,或者未正確稀釋,則會(huì)導(dǎo)致高背景。也不要顯色過度,如有必要,優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。

如果您的ELISA不幸地遇到了高背景,那么也無需太擔(dān)心,依次查看ELISA系統(tǒng)中的組分,并排除可能存在的問題。悉心優(yōu)化,相信很快就會(huì)有漂亮的結(jié)果。

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