LenioBio GmbH是一家專注于蛋白質(zhì)表達解決方案的生物技術(shù)公司。LenioBio總部位于德國杜塞爾多夫，由商業(yè)資深人士和蛋白質(zhì)表達專家于2016年成立。2018年三月，LenioBio簽署了陶氏益農(nóng)的許可協(xié)議，以推出自己專有的無細胞蛋白質(zhì)表達技術(shù)下LenioBio品牌愛麗絲^®。LenioBio目前正在進一步開發(fā)該技術(shù)，通過智能設計進行創(chuàng)新，以利用自然的力量來加速合成生物學。歷史和背后的愛麗絲技術(shù)的特點^®在技術(shù)部分描述。

在LenioBio，我們所做的一切都始于我們的使命：為客戶提供創(chuàng)新的解決方案，以的輕松，快速和的方式應對嚴峻的挑戰(zhàn)。這種深切的承諾是我們的名字Lenio的核心，它源自拉丁語“緩解，減輕，改善”。

LenioBio –應用性更好的科學。

leniobio AL0103500說明書

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描述

“愛麗絲^®是一個*的真核無細胞系統(tǒng)，可以生成一個的3毫克/毫升在批處理模式的蛋白質(zhì)，與市場上的其它真核無細胞系統(tǒng)，它僅產(chǎn)生0.1毫克/毫升或更小進行比較。即使是通常只能處理易于表達的蛋白質(zhì)的原核無細胞系統(tǒng)，也只能以批處理方式產(chǎn)生1 mg / mL的蛋白質(zhì)。”

技術(shù)指標

規(guī)格信息

套件組件

來源于植物細胞的細胞裂解液

保質(zhì)期

12個月

貯存溫度

-70°C至-80°C

活動驗證

至少3毫克的表達/以下愛麗絲的手動時毫升增強黃色熒光蛋白的^®

用戶提供的設備和材料：

手套

•吸管過濾頭（無核糖核酸酶）

•無核糖核酸酶的水（例如來自微孔過濾裝置的水）

•軌道振動篩

o當在試管中進行反應時：

桌面搖床（2毫升容器插入物），搖床直徑：3毫米或0，當在平板中進行反應時：

濕度控制（高達80%）的振動篩，振動直徑：25 mm，帶固定板和96個半孔板（無RNase）

運輸和儲存

Alice®套件采用干冰運輸。到達后，立即按上表所示存放部件。在這些條件下，反應混合物至少穩(wěn)定12個月。

產(chǎn)品使用限制

這個工具包僅供研究之用。不得用于疾病的診斷、預防或治療，也不得用于人類。請參閱我們網(wǎng)站上的有限使用標簽許可證（LULL）：

產(chǎn)品保修

工具包是用干冰冷凍運輸?shù)?。如果交貨時包裝內(nèi)沒有干冰，或者包裝損壞，則可能會影響套件的質(zhì)量。如果交貨有任何問題，請立即與我們聯(lián)系。保修有效期至產(chǎn)品標簽上注明的到期日。

質(zhì)量管理

高質(zhì)量的化學品和材料已被用于制造該套件的組件。每批產(chǎn)品都經(jīng)過仔細的測試，以確保所有部件都符合規(guī)定的規(guī)格（見分析證書）。

安全

使用者應遵守處理化學品和重組DNA的所有適用法規(guī)。處理套件組件時，應穿戴實驗室工作服、安全眼鏡和手套。處理超冷材料時，請戴上額外的防護手套，以免凍傷。使用過的部件應按照當?shù)胤ㄒ?guī)進行處理。

免責聲明

對于因使用、誤用或因使用本工具包而造成的任何直接或間接損害或損失，我們不承擔任何責任。

介紹

從粗細胞提取液中提取的無細胞蛋白表達（cfpe）系統(tǒng)作為一種研究工具已經(jīng)應用了幾十年，并在蛋白表達技術(shù)中引入了許多誘人的優(yōu)勢。

然而，采用cfpe系統(tǒng)替代細胞法的一個關(guān)鍵障礙是蛋白質(zhì)產(chǎn)量相對較低的問題。

為了解決這個問題，Leniobio利用植物細胞生物學的優(yōu)勢，引入了一種新的真核細胞自由表達系統(tǒng)：Alice。Alice®在批處理模式下提供的高達3毫克/毫升的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。因此，它能讓你克服活體宿主系統(tǒng)的限制，在數(shù)小時內(nèi)而不是數(shù)周內(nèi)獲得“難以產(chǎn)生”的蛋白質(zhì)。系統(tǒng)的優(yōu)點

其中包括：

•高產(chǎn)：高達3 mg/ml的表達蛋白

•易于使用：一步反應方案

•快速：僅需48小時即可獲得高產(chǎn)量

靈活：表示“難以生產(chǎn)”蛋白質(zhì)、細胞毒性蛋白等。愛麗絲®利用煙草細胞裂解物，耗盡空泡。該系統(tǒng)包含體外轉(zhuǎn)錄所需的所有因子（rna聚合酶，ntps）和翻譯反應（核糖體，翻譯起始/延伸因子，trna等）。使用一個簡單的協(xié)議，rna轉(zhuǎn)錄和翻譯都發(fā)生在一個單管（耦合轉(zhuǎn)錄/翻譯）。

反應是通過簡單地混合質(zhì)粒DNA與愛麗絲®反應混合物開始的。Alice®的蛋白質(zhì)產(chǎn)量基于反應期間的蛋白質(zhì)表達。因此，我們建議反應持續(xù)時間為48小時。Alice®提供了兩種表達載體，即PALICE01和PALICE02，它們是根據(jù)感興趣蛋白質(zhì)的靶向性而使用的（見第5頁）。當與Alice®表達系統(tǒng)一起使用時，它們被特別定制以提供的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。PALICE01用于在ALICE®胞質(zhì)部分中的表達。以palice02為靶向微粒體提供了通過翻譯后修飾如二硫鍵來表達蛋白質(zhì)的機會。

除篩選外，alice®系統(tǒng)還可用于大規(guī)模表達靶蛋白。

Alice®系統(tǒng)的潛在附加應用包括：

•目標蛋白特性

•蛋白質(zhì)優(yōu)化

•突變篩選

•蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

•表達分析

•蛋白質(zhì)定位分析

•蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

•翻譯后修飾分析

•代謝組學

•除草劑篩選

Alice®表達式向量

Alice®提供了兩個不同的表達式向量：palice01和palice02。palice01作為細胞溶質(zhì)表達載體，而palice02使用信號肽作為微粒體靶向。

微粒體是在Alice®反應混合物的制造過程中，由部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的類似細胞器的結(jié)構(gòu)。利用蜂毒素信號肽，蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)運到這些細胞器中（Buntru等人，2014），在那里進行翻譯后修飾。隨后，微粒體可以被破壞以恢復表達的蛋白質(zhì)（見第9頁）。palice01和palice02也可以作為表達的陽性對照，分別在細胞溶膠和微粒體中加入alice®反應混合物時表達eyfp。

克隆成柵欄載體制備模板

下面提供了包含PALICE01和PALICE02載體特征的地圖（圖1），以及感興趣基因5'和3'方向克隆側(cè)的擴展視圖（圖2和圖3）。

克隆位點允許在t7啟動子和5'未翻譯區(qū)后面插入感興趣的基因?？寺∧愀信d趣的基因既可以從現(xiàn)有的載體中分離出來，也可以通過PCR擴增其編碼區(qū)域來引入適當?shù)南拗泼肝稽c。

細胞溶質(zhì)表達質(zhì)粒palice01的推薦限制位點為ncoⅠ和kpn i，而微粒體表達質(zhì)粒推薦限制位點為ncoⅠ/noti或ncoⅠ/kpni。如果使用kpn i進行克隆，請確保打開的閱讀框包含一個停止密碼子。

dna的純化

為了促進的轉(zhuǎn)錄-翻譯反應，需要高純度的質(zhì)粒dna制備。因此，強烈建議使用基于陰離子交換色譜法的質(zhì)粒制備程序（例如Macherey Nagel的Nucleobond®Xtra Midi）。對于基于二氧化硅基質(zhì)的質(zhì)粒dna制備試劑盒，我們建議在轉(zhuǎn)錄-翻譯反應之前添加rnase抑制劑或苯酚氯方純化模板。根據(jù)插入物的大小，通過添加適當體積的5 mm Tris緩沖液（pH8.5），將終質(zhì)粒DNA調(diào)整到所需濃度。反應混合物中的終濃度應為5nm。在-20℃下分批儲存。耦合轉(zhuǎn)錄/翻譯反應設置耦合轉(zhuǎn)錄-翻譯反應的典型反應體積為50微升。

1）選擇反應容器：

•Alice®試管=每次反應52微升

•96個半孔板，每個反應的Lid1=50微升

2）準備DNA

從倉庫中取出質(zhì)粒dna模板，并在室溫（20-25°C）下解凍。輕輕攪拌，翻轉(zhuǎn)并快速向下旋轉(zhuǎn)，收集試管底部的內(nèi)容物，然后放在冰上。稀釋或濃縮質(zhì)粒，組裝反應的終濃度應為5nm。dna濃度對蛋白質(zhì)產(chǎn)量有顯著影響。

3）解凍Alice®反應混合物

從倉庫中取出Alice®反應混合物，并在室溫（20-25°C）水浴中解凍。通過倒置試管輕輕混合。不要旋渦！解凍后直接放在冰上。解凍后30分鐘內(nèi)開始反應。將剩余的裂解液直接冷凍在-80°C。不要使用液氮！避免一次以上的凍融循環(huán)！