在大腸桿菌蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,我們經(jīng)常會(huì)遇到蛋白表達(dá)不出來、表達(dá)出的蛋白沒有活性、蛋白表達(dá)過程中容易形成包涵體等情況,還要分析出現(xiàn)這些情況的原因。1、目的蛋白不適合在大腸桿菌中表達(dá)。包括稀有密碼子、mRNA結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)等;2、表達(dá)條件需要進(jìn)一步優(yōu)化。比如溫度、分子伴侶、適合的表達(dá)宿主等;3、采用哪種溫和復(fù)性條件可以提高蛋白活性,減少包涵體的形成等等。

除此之外,幾乎每出一點(diǎn)差錯(cuò)就需要重新開始實(shí)驗(yàn),表達(dá)載體的構(gòu)建、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、陽性*的鑒定、培養(yǎng)基的配制、小量誘導(dǎo)摸條件、大量誘導(dǎo)、離心富集細(xì)胞、超聲裂解細(xì)胞、親和富集與純化。又需要額外花費(fèi)一周、幾周甚至半年的時(shí)間,時(shí)間成本高到讓人心煩不已。

現(xiàn)在有一個(gè)新技術(shù)，Biotechrabbit無細(xì)胞體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)——合成生物學(xué)的福音

無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（cell-free protein synthesis system），也叫做體外（in vitro）蛋白表達(dá)系統(tǒng)，本系統(tǒng)中包含轉(zhuǎn)錄、翻譯的全部元件，如T7 RNA聚合酶、核糖體，折疊元件等，加上核酸模板（DNA或者mRNA），無需活細(xì)胞即可以進(jìn)行蛋白合成。

無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（cell-free protein synthesis system），也叫做體外（in vitro）蛋白表達(dá)系統(tǒng)，本系統(tǒng)中包含轉(zhuǎn)錄、翻譯的全部元件，如T7 RNA聚合酶、核糖體，折疊元件等，加上核酸模板（DNA或者mRNA），無需活細(xì)胞即可以進(jìn)行蛋白合成（圖1）。

圖1：體外蛋白表達(dá)原理圖。

一、無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)：

1. 特異性好：只有目標(biāo)蛋白才會(huì)被合成，合成產(chǎn)物無需進(jìn)行復(fù)雜的純化步驟。

2. 不含核酸酶和蛋白酶。

3. 省時(shí)間，操作簡(jiǎn)單：

? ·無需細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)和誘導(dǎo)；

? ·適用于質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增合成的線狀DNA模板；

4. 克服蛋白毒性：即使對(duì)宿主細(xì)胞有毒性的蛋白也可以順利合成。

5. 系統(tǒng)靈活性：

? ·可對(duì)合成系統(tǒng)進(jìn)行個(gè)性化調(diào)整：自行添加chaperones，去垢劑，修飾酶等其他添加物；

? ·可實(shí)現(xiàn)高通量的模板和合成條件的篩選，大大節(jié)省時(shí)間和精力。

圖2：體外和體內(nèi)蛋白合成方法的實(shí)驗(yàn)流程比較。

Biotechrabbit產(chǎn)品技術(shù)亮點(diǎn)：

來自德國(guó)的生產(chǎn)商Biotechrabbit所提供的快速蛋白表達(dá)系統(tǒng)（Rapid translation system, RTS），在傳統(tǒng)的體外蛋白合成方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了升級(jí)，通過以下兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)大大改善了體外蛋白合成的效率：

1. 無細(xì)胞持續(xù)交換系統(tǒng)（Continuous Exchange Cell-Free, CECF）

通過持續(xù)補(bǔ)充蛋白合成所需的底物和能量，并不斷吸收對(duì)蛋白合成反應(yīng)有抑制作用的副產(chǎn)物，來延長(zhǎng)合成反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。

圖3：CECF技術(shù)原理圖。

2. 特殊的能量供給方法High yield (HY) biochemistry：

配合優(yōu)化的緩沖液配方，以糖酵解的方式為持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的合成反應(yīng)提供穩(wěn)定足夠的能量。

圖4：不同方法的體外蛋白合成系統(tǒng)得率對(duì)比。紅色線為傳統(tǒng)產(chǎn)品，藍(lán)色和綠色線分別為Biotech的CECF技術(shù)和CECF加HY技術(shù)的產(chǎn)品。

RTS產(chǎn)品：

目前為止，Biotechrabbit所提供的RTS有三種不同宿主細(xì)胞來源的產(chǎn)品，分別是大腸桿菌E. Coli，昆蟲細(xì)胞和麥芽細(xì)胞。常用的E. Coli來源試劑盒以凍干粉形式提供，易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。不同大小規(guī)格可滿足科研用戶和工業(yè)用戶的不同產(chǎn)量需求：

1. RTS E. coli 100 HY

? BR1400101, 24 rxn

? BR1400102, 96 rxn

? 高通量形式助你快速篩選最合適的質(zhì)粒和*表達(dá)系統(tǒng)，適合環(huán)狀和線狀DAN模板。

2. RTS 500 E. Coli ProteoMaster HY

? BR1400201, 5 rxn, 1ml, 6mg

? 中等規(guī)模反應(yīng)，適合環(huán)狀DAN模板。

3. RTS 9000 E. coli HY

? BR1400301, 1 rxn, 10ml, 50mg

? 中等規(guī)模反應(yīng)，適合環(huán)狀DAN模板。

4. 除此以外，還有二硫化蛋白合成試劑盒RTS E. coli Disulfide kits

? BR1400401, 24 rxn, 50µl

? BR1400501, 5 rxn, 1 ml

? 適合需要表達(dá)具有空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)

上海起發(fā)代理Biotechrabbit的全線產(chǎn)品，包括無細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)品，凍干粉形式的PCR/qPCR mix。